Peignage moléculaire d'ADN.

Cartographie physique du génome et diagnostic génétique

 
Xavier MICHALET et Aaron BENSIMON
 
Laboratoire de Biophysique de l'ADN
Département des Biotechnologies
Institut Pasteur
25, rue du Dr Roux
75724 Paris cedex 15
Article publié dans Médecine/Sciences 1997; 13: 1299-1305.

Résumé

Le peignage moléculaire permet la préparation reproductible de surfaces couvertes d'une haute densité de molécules d'ADN parallèles les unes aux autres et étirées avec un taux constant et uniforme. L'utilisation de méthodes d'hybridation fluorescentes classiques en fait un outil performant pour la cartographie physique haute résolution de clones, permettant notamment de lever toutes les ambiguïtés subsistant dans les cartes de restriction, mais aussi de se dispenser de l'établissement de telles cartes. Enfin, dans le domaine du diagnostic génétique, la détection de micro-délétions de quelques dizaines de kilobases à partir d'ADN génomique de patients illustre les potentialités de la technique pour l'étude du génome humain.
 
 

L'étude du génome

Avec les progrès techniques de la biologie moléculaire, l'accroissement du nombre de scientifiques impliqués dans la recherche génétique académique ou industrielle, et depuis quelques années, les investissements considérables du Projet Génome Humain, la connaissance du rôle des gènes et de leurs éventuelles mutations dans l'apparition et le développement de nombreuses maladies a progressé de façon exponentielle [1].

Diverses stratégies de recherche et d'études des gènes existent, et leur liste n'est sans doute pas close. Toutes ont pour but commun l'obtention de la séquence d'une partie du génome contenant le gène impliqué dans la pathologie étudiée. L'une de ces stratégies est le "clonage positionnel", qui permet d'aboutir en partant d'un ensemble de familles de patients, à la localisation physique sur l'un des 22 chromosomes autosomaux ou des 2 chromosomes sexuels d'un ou plusieurs vecteurs de clonage contenant le gène (de type cosmide, par exemple). Cette localisation précise permet ensuite de procéder au séquençage et à l'identification du gène, à sa mutagénèse dirigée dans des modèles animaux, à l'étude de son profil d'expression en présence de différents traitements, ou dans un premier temps, à l'élaboration de diagnostics génétiques.

Le clonage positionnel comprend quatre étapes successives [2]: analyse de liaison génétique à l'aide de marqueurs chromosomiques permettant de déterminer une région chromosomique impliquée dans la pathologie, recherche de clones recouvrant la région chromosomique en question, établissement d'une carte physique des clones obtenus, séquençage systématique, criblage d'ADNc candidats conduisant in fine à l'identification d'un gène.
Malgré des progrès dans l'ensemble des techniques employées pour le clonage positionnel, consistant aussi bien en développements nouveaux (développement de cartes génétiques denses [3], développement de banques de clones couvrant le génome humain [4]), qu'en l'automatisation ou l'informatisation de techniques classiques, la découverte d'un gène représente encore une entreprise de longue haleine, demandant des moyens humains et financiers très lourds. Les résultats de ces efforts sont toutefois d'un intérêt considérable pour la mise au point de thérapies ou de diagnostics. Dans le cas de pathologies à détection tardive notamment (phénotype à évolution lente), le diagnostic génétique laisse envisager un traitement préventif plus efficace.

Parmi les techniques nouvelles d'étude du génome apparues [5-8], permettant en principe d'accélérer le clonage positionnel, ou au moins de lever certaines ambiguïtés, le "peignage moléculaire" que nous avons développé au laboratoire de Biophysique de l'ADN de l'Institut Pasteur, est une technique de visualisation directe de la position de clones, susceptible de considérablement améliorer la précision et de simplifier la cartographie physique. Nous montrons ici son application à la cartographie directe haute résolution et au diagnostic génétique de micro-délétions grâce à l'utilisation de techniques d'hybridation fluorescente classiques.
 

Le peignage moléculaire ou comment étirer l'ADN de façon contrôlée

Le peignage moléculaire désigne un procédé de fixation d'ADN purifié sur des surfaces, découvert en 1993 à l'Institut Pasteur et à l'Ecole Normale Supérieure [9,10]. Il consiste à:
ancrer spécifiquement par leurs extrémités des molécules d'ADN en solution, étirer ces molécules à l'aide de la tension superficielle d'un ménisque en mouvement.
La figure 1 illustre la mise en œuvre la plus simple de ce principe. Des molécules d'ADN débarrassées de toute protéine par un traitement à la protéinase K sont mises en solution dans une solution tamponnée de MES 50 mM pH 5.5, et déposées sur une surface de verre traitée de façon à ne permettre qu'une adsorption spécifique de l'ADN par ses extrémités [9-11]. Pendant la durée d'incubation de quelques minutes, les molécules d'ADN qui adoptent en solution une conformation de globule (ou pelote statistique), animées d'un mouvement brownien, entrent aléatoirement en contact avec la surface traitée, et, éventuellement, finissent spontanément par s'ancrer par l'une de leurs extrémités sur la surface.
La deuxième étape du procédé consiste à retirer de façon contrôlée la solution dans laquelle l'ADN est en solution, de façon à provoquer un déplacement régulier du ménisque sur la surface. Lors du passage du ménisque, c'est-à-dire de la ligne frontière entre la solution, l'air et la surface, la partie non ancrée de la molécule qui se présente sous la forme d'une pelote statistique (représentée par des boucles sur la figure 1A et 1B) reste en solution et est donc entraînée dans la direction de déplacement du ménisque. Comme la molécule est ancrée par l'extrémité qui se trouve désormais hors de la solution, il en résulte un débobinage de la pelote statistique. La force exercée par le ménisque étant supérieure à la résistance élastique de l'ADN, la molécule est de surcroît étirée par rapport à sa longueur non contrainte (ou longueur cristallographique). Enfin, une fois le ménisque passé, on constate une fixation irréversible de la molécule étirée sur la surface.
 
figure 1
Figure 1. Principe du peignage moléculaire.  (A) Dans cette expérience schématisée, la solution d'ADN purifié est simplement déposée sur une surface traitée, et couverte par une surface de verre qui crée un mince film aqueux. Certaines molécules viennent spontanément s'ancrer par leurs extrêmités sur la surface traitée. (B) Par simple évaporation de la solution par les bords, le volume de la solution diminue, et la frontière air-eau se rétracte, entraînant avec elle les parties non fixées des molécules d'ADN. (C) Après complète disparition de la solution, les molécules d'ADN se retrouvent fixées sur la surface, et étirées avec un taux uniforme. La distance entre les deux surfaces (quelques microns) et la molécule d'ADN schématisée ne sont évidemment pas représentées à la même échelle.
 

La particularité de l'étirement ainsi réalisé est son extrême régularité:

La figure 2 montre une surface de verre (traitée à l'aide d'un dérivé de silane [9-11]), sur laquelle a été peignée une solution d'ADN de phage lambda, visualisé à l'aide de molécules fluorescentes s'intercalant partiellement entre les bases de l'ADN (YOYO-1, Molecular Probes). L'ensemble des molécules est orienté dans une direction unique, et leur taille est constante, de l'ordre de 25 micromètres (µm). Connaissant précisément la taille du génome du phage lambda, qui est de 48.5 milliers de bases (kb), on en déduit une extension d'environ 2 kb/µm. Cette extension est en outre indépendante de la taille et est parfaitement reproductible. Comparée à la taille cristallographique de 16.2 µm, le procédé permet un étirement d'un facteur 1.54.
 
Figure 2
Figure 2. ADN peigné observé par microscopie d'épifluorescence. Une solution d'ADN purifié de phage ( (0.25 µg/ml) préalablement incubée avec des molécules fluorescentes s'intercalant dans l'ADN, a servi pour le peignage sur des surfaces traitées à l'aide de dérivés du silane. Le champ de vue photographié à l'aide d'une caméra  intensifiée contient une majorité de segments de 25 microns environ. Les fragments plus petits sont dus à des cassures aléatoires qui ont lieu avant ou lors de la préparation. La barre de mesure représente 10 microns.
 

Grâce à quelques perfectionnements, cette technique de peignage moléculaire peut être maintenant utilisée avec tous les types de génome, du plus petit au plus grand, comme l'ADN génomique humain, qui représente environ 3 mètres d'ADN peigné par cellule [12]. A partir d'un échantillon de quelques µg d'ADN préservé dans un bloc d'agarose à bas point de fusion,  plusieurs centaines de génomes peuvent être peignés sur une surface de 22x22 mm2 en quelques minutes et un nombre quasi illimité de surfaces peut être préparé de façon  reproductible [12].
 

Hybridation fluorescente sur ADN peigné

Les perspectives d'utilisation de ce procédé dans le domaine génétique sont nombreuses. En particulier, l'ADN peigné étant irréversiblement fixé sur la surface de peignage, il est possible d'utiliser les protocoles d'hybridation fluorescente in situ (FISH) [13] pour détecter, mesurer et positionner des sondes nucléotidiques particulières dans n'importe quel génome [12].

Les techniques de FISH consistent d'une part dans le marquage d'ADN sonde double brin par des nucléotides modifiés reconnaissables par des systèmes d'anticorps fluorescents. Dans un second temps, cet ADN sonde est dénaturé et hybridé avec l'ADN cible, pour permettre une hybridation des sondes avec leurs séquences cibles. La révélation de ces sondes par leurs systèmes spécifiques d'anticorps fluorescents permet de repérer leur position.
A la différence des techniques classiques utilisant la FISH (sur chromosomes métaphasiques, ADN interphasique, halo, etc) [14-16], la mesure de la taille ou de la distance des signaux d'hybridation est directement traduisible en une distance physique en kilobases, en utilisant l'échelle de 2 kb/µm obtenue par des mesures exhaustives dans le cas des surfaces silanisées utilisées au laboratoire (voir Figure 3 et l'article de Monier et coll. dans ce numéro). En tenant compte de ce que la résolution théorique d'un microscope ne dépasse pas 0.2 à 0.25 microns, une précision des mesures sur ADN peigné de l'ordre de 0.5 kb est en principe accessible. En pratique, du fait de la variabilité de l'hybridation, il est nécessaire de prendre des mesures sur un échantillon représentatif de quelques dizaines de signaux d'hybridation. L'ensemble des mesures donne une distribution statistique de tailles ou de distances, caractérisée par un valeur modale (pic de la distribution) et une certaine dispersion, qui donne la précision de la mesure, qui est en général de quelques kb.
 

Figure 3


 Figure 3. Exemple de FISH sur ADN peigné. L'ADN peigné est constitué par le génome d'une souche de levure contenant un chromosome artificiel (YAC 774G4) incluant 1.6 Mb de génome humain. Ce YAC couvre une région du chromosome 15q15.2 dans laquelle a été découvert le gène CANP3 responsable de la dystrophie musculaire des ceintures de type 2A. L'hybridation simultanée de deux cosmides révélés en deux couleurs différentes (1F11: vert, 3A4: rouge) permet la mesure précise de leurs tailles et de leur distance par analyse d'un échantillon statistique de quelques dizaines de mesures. La barre de mesure représente 10 microns.
 
 

Cartographie physique du génome

L'application de ces techniques (peignage moléculaire et FISH) à la cartographie physique est sans doute la plus évidente. En collaboration avec Françoise Fougerousse, du groupe du Dr Jacques Beckmann au Généthon, nous avons ainsi cherché à déterminer l'orientation transcriptionnelle du gène de la calpaine 3 situé sur le chromosome 15q15.2, dont des mutations sont responsables d'une dystrophie musculaire des ceintures (LGMD 2A) [12,17,18].

Pour ce faire, des cosmides appartenant à deux contigs déjà ordonnés à l'aide de marqueurs STS (Sequenced Tag Site) et dont l'un contenait le gène, l'autre étant d'orientation chromosomique connue, ont été hybridés deux par deux sur l'ADN peigné d'une souche de levure contenant un insert d'ADN génomique humain de 1.6 Mb (YAC 774G4) couvrant la région du gène. La densité de peignage obtenue permet en effet de ses dispenser d'isoler préalablement le chromosome artificiel à étudier, qui ne représente pourtant que quelques pourcents du génome total (12.6 Mb). L'ADN de levure est en quelque sorte un ADN muet dans cette expérience où sont hybridées des séquences spécifiques du génome humain.
Pour chaque paire de cosmides, l'un des cosmides était révélé à l'aide d'un système d'anticorps couplé à la FITC (fluorescence verte), l'autre étant couplé au Texas Red™ (fluorescence rouge). La figure 3 montre un champ de vue caractéristique d'une lame observée avec un microscope à épifluorescence équipé d'un objectif x100 et d'une caméra CCD (Charge Coupled Device) refroidie.
La mesure directe des tailles et distances sur quelques dizaines de couple de cosmides pour chaque expérience permet la construction immédiate d'une carte précise de la région, sans ambiguïté sur l'orientation des cosmides, la taille des éventuels intervalles, dès lors qu'un nombre suffisant d'hybridations est utilisé. La carte résultante de la région étudiée (environ 200 kb) est représentée sur la figure 4.
 

Figure 4

Figure 4. Cartographie physique sur ADN peigné. (A) carte STS de la région du gène CANP3 contenu dans les cosmides 1F11 et 1G3. La direction centromérique est à gauche, le télomère à droite. Chaque graduation représente un STS. Les STSs sont représentés équidistant par convention, leur distance physique étant inconnue. Les cosmides utilisés dans notre étude sont représentés en couleur, chaque couleur correspondant à un contig dictinct. (B) Cartographie physique par FISH sur ADN peigné avec une résolution de quelques kb. La figure montre des hybridations typiques, avec le nom des cosmides utilisés. (C) Carte schématisée de la région, à partir des résultats de la FISH sur ADN peigné. Les deux contigs sont donc retournés par rapport à leur positionnement hypothétique dans la carte STS figurée en (A).

Il est intéressant de noter qu'aucun des deux contigs n'avait l'orientation supposée dans les travaux précédents (fondés sur des marqueurs STS), montrant de ce fait la puissance de la méthode pour lever des ambiguïtés difficilement résolvables par les méthodes de biologie moléculaire standard.
L'ensemble des mesures obtenues avec une précision de quelques kb, a par ailleurs permis de vérifier l'autonomie de cette nouvelle technique de cartographie physique puisque ces résultats ont pu être obtenus sans connaissance préalable des tailles des cosmides, ni de leurs distances, c'est-à-dire sans contrôle interne. Pour vérifier la cohérence de ces mesures, nous avons effectué un certain nombre d'hybridations redondantes qui nous ont permis de vérifier que les mesures surnuméraires correspondaient à celles prédites par notre carte, sans aucun besoin de renormalisation ou d'adaptation des mesures.
Nous avons étendu cette méthode de cartographie de cosmides à l'ADN génomique humain peigné, à l'occasion de l'étude de contigs de cosmides recouvrant une région du chromosome 9 impliquée dans une des formes de la Sclérose Tubéreuse (TSC1) [12]. Pour donner une idée de la différence avec l'expérience précédente, il suffit de rappeler la taille d'un génome diploïde humain après peignage: environ 3 mètres, sur lesquels seuls quelques centaines de micromètres représentent la région à cartographier (soit 1/10 000 ème). Malgré cette différence de "rendement" de l'ADN peigné, nous avons pu obtenir des mesures statistiques d'intervalle ou de distance entre cosmides sur une seule surface de 22x22 mm2 avec une précision de quelques kb, en augmentant considérablement la densité d'ADN peigné [12].
La FISH sur ADN peigné apparaît de ce fait comme la seule technique de cartographie physique permettant d'obtenir directement et sans ambiguïté une carte physique haute résolution, sans nécessité de faire appel à d'autres techniques. Toutefois, si des distances de quelques kb à plusieurs centaines de kb sont accessibles sans difficulté, les échelles de distance supérieures nécessitent de faire appel à des techniques moins précises mais plus adaptées, comme la FISH sur chromosomes métaphasiques. La limite supérieure dépend en fait non seulement des manipulations de l'ADN (réduites au minimum) préalablement au peignage, puisque celles-ci peuvent conduire à des cassures importantes des fibres, mais aussi à la distance physique (en micromètres) des signaux. En effet, plus les signaux d'hybridations sont éloignés, plus il est difficile de les associer sans ambiguité par paire, et donc de mesurer leur distance.

L'extension de la technique à l'ADN génomique ouvre d'importantes perspectives, puisqu'il permet en principe de se dispenser des clones de grande taille comme les YACs ou les BACs pour réaliser la cartographie physique de clones plus petits (cosmides, PACs, etc). Ces clones, qui sont d'une grande utilité pour cartographier à grands traits une région chromosomique, sont cependant sujets à des remaniements qui peuvent parfois fausser les résultats obtenus. Grâce aux développements que nous avons décrits, un ADN humain standard peut désormais servir à l'étude de n'importe quelle région du génome. Il n'est donc pas exclu que de nouvelles stratégies de clonage positionnel performantes résultent de cette extension des potentialités du peignage moléculaire.
 

Diagnostic génétique de micro-délétions

Le peignage moléculaire d'ADN génomique n'est pas intéressant uniquement du point de vue de la cartographie physique. L'ADN génomique de chaque individu diffère sensiblement de l'ADN d'un autre individu, par des mutations ponctuelles, des répétitions de motifs, mais parfois aussi, par des modifications plus importantes, de l'ordre de quelques kilobases à plusieurs mégabases. Ce sont précisément ces modifications génétiques de plusieurs kb (souvent pathologiques) que le peignage moléculaire et les techniques décrites dans le cadre de la cartographie physique, sont susceptibles de détecter de manière extrêmement efficace et rapide.

En collaboration avec Rosemary Ekong et Sophie Rousseaux, du groupe du Pr Sue Povey, du Medical Research Council de Londres, nous avons ainsi appliqué notre technique à l'étude de micro-délétions du gène TSC2 impliqué dans une des formes de la Sclérose Tubéreuse [12,19]. Cette première expérience visait à vérifier la possibilité de réaliser un diagnostic génétique de délétions connues.
La connaissance précise de la région 16p13.3 impliquée, et la détermination par gel d'électrophorèse en champ pulsé (PFGE) de la nature des délétions de plusieurs patients nous a permis de sélectionner deux cosmides encadrant la région concernée. Le principe du diagnostic est explicité sur la figure 5, qui montre le résultat de l'hybridation de ces deux cosmides sur l'ADN d'un individu sain et sur celui d'un patient atteint de Sclérose Tubéreuse. Dans le cas de l'individu sain, la distance mesurée entre tous les couples de sondes est unique et vaut environ 150 kb. Pour l'échantillon d'ADN peigné provenant du patient TSC2, deux types de mesures sont possibles: une partie des couples de cosmides donne le résultat précédent (qui correspond aux hybridations s'effectuant sur le chromosome 16 non délété), mais une partie des mesures donne une valeur inférieure, de l'ordre de 90 kb. Cette dernière valeur permet de déterminer la taille précise de la délétion (environ 70 kb), qui en l'occurence emporte une partie de la séquence correspondant à l'un des cosmides utilisés.
 

Figure 5

Figure 5. Diagnostic de micro-délétions sur ADN génomique peigné. La Sclérose Tubéreuse TSC2 a pour origine une micro-délétion d'une partie du chromosome 16. Le principe du diagnostic de ces délétions consiste à hybrider simultanément deux cosmides encadrant la région critique. Six exemples d'hybridations représentatives parmi les dizaines de mesures effectuées sont présentées pour chaque patient étudié. L'individu normal possède un locus intact sur les deux chromosomes 16 et présente donc une seule figure d'hybridation des deux cosmides distants d'environ 150 kb. Dans le cas du patient atteint de TSC2, une partie des signaux d'hybridation donne une distance entre sondes d'environ 150 kb qui correspond à l'allèle normal, l'autre partie donnant une distance de 90 kb, qui correspond à l'allèle délété. De surcroît, la taille du signal correspondant à l'une des sondes est systématiquement inférieure à sa taille normale (flèches vertes), indiquant qu'une partie de la cible correspondante a également été délétée dans le chromosome du patient.

Le diagnostic est donc obtenu de façon immédiate, une seule surface d'hybridation étant suffisante pour accumuler les quelques dizaines de mesures nécessaires à un diagnostic précis, avec en sus une information sur l'hétérozygoticité du patient pour ce locus.

L'ADN d'autres patients a été étudié de cette façon, avec des délétions variant entre une dizaine de kb et près de 150 kb, en accord avec les résultats obtenus par PFGE. Cette distance de 150 kb ne constitue évidemment pas un maximum, tout autre choix pour les cosmides entourant la région cible ayant pu convenir.  Toutefois, comme nous l'avons déjà noté, les cassures aléatoires de l'ADN au cours des manipulations, qui augmentent avec la taille de la région cible, jouent un rôle dans la limitation de la taille maximale mesurable, de même qu'une trop grande distance entre sondes peut rendre les mesures difficiles.
De façon similaire, la technique de peignage moléculaire permet en principe d'étudier des micro-duplications ou des micro-insertions au sein d'une région connue du génome.
 

Perspectives

Les applications que nous avons présentées n'épuisent pas les potentialités du peignage moléculaire.
En ce qui concerne les applications utilisant l'hybridation fluorescente, nous avons par exemple étudié, en collaboration avec le laboratoire du Pr. Thomas Cremer  de l'Institut de Génétique Humaine et d'Anthropologie de Münich, la possibité d'étendre les techniques d'hybridation comparative pour le dosage d'amplifications de séquences au sein du génome [20]. Cette étude ne représente toutefois que l'une des approches possibles utilisant le peignage moléculaire pour l'analyse des amplifications de gènes, un phénomène qui intervient notammment dans la carcinogénèse.
Différentes études sont également en cours sur l'application de l'hybridation fluorescente sur ADN peigné à la cartographie de très petites sondes, comme les ADNc: la très nette distinction entre bruit de fond et signal, illustrée sur la figure 3, permet en effet d'envisager la cartographie de sondes de quelques kb ou moins (voir l'article de Monier et coll. dans ce numéro), et de leur éventuelle utilisation pour le diagnostic. A l'autre extrême du spectre, les très grandes distances sont une voie de recherche prometteuse pour essayer de faire le lien entre la très haute résolution de la FISH sur ADN peigné, et les distances de quelques Mb et davantage habituellement estimées par hybridation sur chromosomes métaphasiques.
Enfin, la possibilité d'utiliser directement l'ADN génomique de n'importe quel organisme offre un outil important pour l'étude comparative des espèces et de leur synténie, un domaine particulièrement important à l'heure où beaucoup de recherches thérapeutiques s'effectuent sur des modèles animaux.

Dans le domaine du diagnostic, un vaste champ complémentaire à celui occupé par la PCR ou les techniques se focalisant sur les modifications ponctuelles ou très petites du génome (séquençage, puce ADN [4]) est ouvert. Mais les caractéristiques du peignage moléculaire permettent d'espérer que d'autres types de diagnostics pourront être mis en place, qui tireront parti de sa reproductibilité, de sa précision et de son caractère d'observation directe qui le garantit des ambiguïtés de techniques indirectes. Ces caractéristiques, ajoutées à la possibilité d'automatisation des étapes de préparation et d'analyse font assurément du peignage moléculaire d'ADN une technologie d'avenir.
 

Remerciements

Nous tenons à remercier Catherine Schurra pour son inappréciable aide technique.
 
 

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